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SD大鼠肝內(nèi)膽管上皮細胞，使用方法

更新時間：2019-08-22 點擊次數(shù)：2551次

　　SD大鼠肝內(nèi)膽管上皮細胞，使用方法；

　　1、您收到細胞后，請按照以下方法進行操作：

　　取出25cm2培養(yǎng)瓶，75%酒精擦拭培養(yǎng)瓶，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中靜置3-4小時以穩(wěn)定細胞狀態(tài)，然后換用新鮮*培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)或進行傳代。

　　2、細胞傳代：

　　1)細胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細胞一次；

　　2)添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后加入*培養(yǎng)液終止消化，再輕輕吹打細胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5min；

　　3)棄上清，沉淀細胞用12ml*培養(yǎng)基重懸，然后按1:2比例進行分瓶傳代，后放入37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

　　4)待細胞*貼壁后，觀察培養(yǎng)結(jié)果，之后進行換液培養(yǎng)或傳代。

　　3、細胞凍存：

　　1)細胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細胞一次；

　　2)添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后加入*培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打細胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5min；

　　3)用適量的凍存液(FBS：DMSO=9 ：1)重懸細胞，并放置于凍存管中；

　　4)先將細胞凍存管放置于-20℃ 1.5h，然后將其移入-80℃過夜，24h后轉(zhuǎn)入液氮中進行長期保存。使用程序降溫盒可直接放入-80℃。

　　4、細胞復蘇：

　　1)從液氮中取出細胞凍存管(注意：佩戴防爆管面具)，快速將其置入37℃水浴中解凍，直至凍存管中無結(jié)晶，然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁；

　　2)將凍存管中的細胞移至含5ml*培養(yǎng)基的15ml離心管中， 1000rpm離心5min；

　　3)棄上清，沉淀用5ml*培養(yǎng)基重懸，接種25cm2培養(yǎng)瓶，于37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

　　4)第二天，換用新鮮*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

　　SD大鼠肝內(nèi)膽管上皮細胞，細胞傳代：收到細胞后，請對細胞培養(yǎng)瓶外表進行消毒，將細胞置于培養(yǎng)箱中進行 1-2 小時的緩沖，待細胞恢復基本生長狀態(tài)后，進行后續(xù)細胞實驗。在倒置顯微鏡下觀察整個細胞生長情況：

　　(一)細胞未長至 85%時，用 75%酒精噴灑整個瓶消毒后放到生物操作臺內(nèi)，嚴格無菌操作，打開細胞培養(yǎng)瓶，若培養(yǎng)瓶上無特殊標注，吸去剩余培養(yǎng)液，只留 6-8ml 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

　　(二)細胞已長滿(達 85-95%)。即可進行傳代，具體步驟如下：

　　1.棄去培養(yǎng)液，用 PBS 洗滌 1-2 次，

　　2.加入 1.0ml 胰酶消化液，37℃消化，顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞回縮變圓、透亮、輕拍甁壁呈流沙樣脫落，則迅速拿回操作臺，加入雙倍的含 10%血清的*培養(yǎng)液，終止消化并輕輕吹打細胞，使其變成單細胞懸液，

　　3.將細胞收集于離心管中離心 1000rmp/5min，棄上清，輕彈管底，將細胞彈散，

　　4.加入新鮮培養(yǎng)液重懸細胞，進行傳代、凍存，

　　5.如果沒有特別說明，建議收到細胞后的次傳代比例為 1:2。

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